赣南脐橙作为中国赣州地理标志性产品，带动了当地经济的发展，深受当地政府重视，该产地也成为了全国最大的脐橙生产区^［1］。脐橙在贮藏过程中易受病原菌侵害，导致其腐烂，造成经济损失^［2］。目前，采用化学保鲜剂是柑橘类水果储存中病害防治相对成熟、效果较好的保鲜方式。抑霉唑（Imazalil，IMZ）和咪鲜胺等化学保鲜剂主要用来防治脐橙的青霉病和绿霉病^［2,3］，但该类保鲜剂长期使用容易产生耐药性，进而引起保鲜效率的折损。不少商贩为了达到保鲜效果，在贮藏过程中加大保鲜剂的使用剂量，造成脐橙中抑霉唑过量残留。而且，即便是少量的抑霉唑残留也会使动物和人类的肝脏损伤，甚至可能致癌^{［4, 5］}。为此，中国规定了脐橙中抑霉唑保鲜剂残留的最大限量为5 mg/kg^［6］。为了确保脐橙的食用安全品质，检测脐橙果皮中抑霉唑的残留量具有重要的实际意义。

目前常用的抑霉唑残留检测方法主要有气相色谱法（Gas Chromatography，GC）^{［7, 8］}、高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）^{［9, 10］}、质谱法（Mass Spectrometry，MS）^{［7, 9］}和超高效液相色谱法（Ultra-Performance Liquid Chromatography，UPLC）^［10］等。以上方法主要优点在于再现性好、精确性和敏感性高，但所需要的仪器设备较昂贵^［11］，试验操作繁琐，耗时长，无法实现对抑霉唑残留量的快速检测，在实际应用中受到一定的限制。因此，有必要探索一种可以快速检测脐橙果皮中抑霉唑残留的方法。

表面增强拉曼光谱技术（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）是一种当入射激光照射到金或银等粗糙金属表面时，在其表面会激发出等离子体并在粗糙金属粒子的覆盖区域内产生共振，使其表面产生比普通拉曼信号强4~11个数量级的信号强度的技术，该方法具有方便快捷、灵敏度高、稳定性好、操作简单和可适用于现场分析的优点^{［12, 13］}。Zhao等^［11］采用SERS技术制备了柔性衬底，对苹果表面抑霉唑残留进行原位检测，在苹果上检测到的最低浓度可达0.073 mg/kg。该研究表明，SERS方法具有较高的灵敏度。抑霉唑在水果采后保鲜的过程起到非常重要的作用。为避免由于脐橙果皮抑霉唑残留问题对人体造成伤害，采用SERS技术检测脐橙果皮中抑霉唑残留具有重要意义。本研究主要以脐橙为对象，采用自适应迭代惩罚最小二乘法（Adaptive Iterative Reweighted Penalized Least Squares，air PLS）对含不同浓度的抑霉唑的脐橙果皮的SERS光谱进行预处理，并选择前7个主成分得分值作为支持向量回归（Support Vector Regression，SVR）模型的输入值，建立SVR预测模型对脐橙果皮中的抑霉唑残留量进行预测。

便携式拉曼光谱仪系统主要包括QE65Pro型拉曼光谱仪（美国海洋光学公司）、785 nm 激光器、光纤和采样附件等；DXR^TM显微拉曼光谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）；磁力搅拌器（LC-DMS-H，上海力辰邦西仪器科技有限公司）；数控超声波清洗器（KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司）；电子天平（FA2004，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；实验室超纯水机（美国TeLedyne水质公司）。

本研究所用脐橙购于江西农业大学水果店。研究所用试剂包括三水合四氯金酸（HAuCl₄·3H₂O≥49.0%，西格玛奥德里奇贸易有限公司），抑霉唑乳油（500 g/L，江苏龙灯化学有限公司），抑霉唑标准品（IMZ，纯度≥99%，阿拉丁），柠檬酸三钠（C₆H₅Na₃O₇·2H₂O，99%，西陇化工股份有限公司），溴化钙（CaBr₂，≥98%，阿拉丁），溴化钠（NaBr，99%，阿拉丁），氯化钙（CaCl₂，分析纯，纯度98%），氯化钠（NaCl，99.5%，西陇化工股份有限公司），以及实验室自制超纯水。

（1）抑霉唑原液配制。取100 µL的抑霉唑乳油（500 g/L）置于100 mL容量瓶中，加入62.5 mL的超纯水均匀混合，得到800 mg/L的抑霉唑原液。

（2）抑霉唑工作溶液制备。取不同体积的乳油（500 g/L）用超纯水稀释成不同质量浓度的抑霉唑工作溶液（250~500 mg/L）。

（3）样本制备。将脐橙的果皮用超纯水洗净，晾干后将果皮切成若干个面积为1.5 cm×1.5 cm的脐橙小块，对其进行称重（a，单位：g）。

在条件优化试验中，将切好的脐橙小块浸泡于抑霉唑溶液（800 mg/L）中，90 s后捞出晾干，再对其称重（b，单位：g），得到含40.34 mg/kg抑霉唑的脐橙果皮样本。

在定量试验中，将切好的65个脐橙小块浸泡于抑霉唑溶液（250~500 mg/L）中，90 s后捞出晾干，再对其称重（b，单位：g），得到含抑霉唑的脐橙果皮样本（1.43~40.81 mg/kg）。未浸泡在抑霉唑中的脐橙果皮样本为空白脐橙果皮样本。其中，在条件优化试验部分与定量试验部分中，a为脐橙果皮的初始重量，b为浸泡抑霉唑溶液且晾干后的重量；b-a可得到脐橙果皮中抑霉唑的重量，g；设c为抑霉唑溶液的浓度，mg/kg，则（b-a）×c为脐橙果皮抑霉唑实际吸收抑霉唑的重量，mg；（b-a）×c/b则为每块脐橙果皮上实际吸收的抑霉唑的浓度，mg/kg。

（4）金胶制备。取3 mL浓度为1%的HAuCL₄溶液于150 mL的烧杯中，再慢慢加入47 mL超纯水，混合均匀，将混合液放至磁力搅拌器中加热到沸腾。沸腾后立即加入2 mL浓度为1%的柠檬酸三钠溶液，并搅拌8 min后，冷却至室温形成金胶溶液备用^{［14, 15］}。

（5）电解质溶液制备。取0.1 g CaBr₂、0.55 g CaCl₂、5.14 g NaBr和2.9 g NaCl分别置于棕色的50 mL容量瓶中，先加入少量水溶解，再定容至50 mL，可分别得到0.01 mol/L的CaBr₂溶液、0.1 mol/L CaCl₂溶液、1 mol/L NaBr和1 mol/L NaCl溶液。

抑霉唑标准品拉曼光谱采集。取适量的抑霉唑标准品于载玻片上，用DXR^TM显微拉曼光谱仪采集其拉曼光谱。本研究主要分析400~1800 cm^-1波段的拉曼光谱。

定性试验中脐橙果皮SERS光谱采集。将400 µL纳米金胶和25 µL NaBr溶液充分混合后喷到含40.34 mg/kg抑霉唑的脐橙小块上，待金胶与抑霉唑分子反应2 min后，采集其SERS光谱。每个优化条件下，设置5个平行样，取其平均值为该条件下的拉曼光谱。

定量试验中脐橙果皮SERS光谱采集。将400 µL纳米金胶和25 µL NaBr溶液充分混合后喷到含抑霉唑的脐橙小块（1.43~40.81 mg/kg）上，采集脐橙的SERS光谱。每个浓度下的脐橙样本采集5条拉曼光谱作为平行样，取其平均值作为该样本的拉曼光谱。

其中，DXR^TM显微拉曼光谱仪的参数设置为：激光能量5 mW，激发波长780 nm，物镜的放大倍数选择10倍，采集曝光时间10 s，预览采集时间10 s，样品曝光10次，背景曝光16次。便携式拉曼光谱仪的参数设置为：积分时间为60 s，平均次数为2，平滑度为1。

通过比较空白脐橙果皮和含抑霉唑的脐橙果皮（40.34 mg/kg）的SERS光谱，得到983和1047 cm^-1波段作为特征峰鉴别脐橙果皮中是否残留抑霉唑。因此，本研究通过比较983和1047 cm^-1波段处的SERS信号强度来确定最佳的检测条件。

为研究不同反应时间对SERS强度的影响，将400 µL金胶与25 µL的NaBr溶液混合均匀后喷洒到含40.34 mg/kg抑霉唑的脐橙样本上，分别采集反应时间为0、2、4、6和8 min时的SERS光谱。通过比较983和1047 cm^-1波段处的SERS信号强度与反应时间的关系来确定抑霉唑分子与金胶的最佳反应时间。

为研究不同金胶加入量对SERS强度的影响，分别将80、240、400、560和720 µL的金胶与25 µL的NaBr溶液混合均匀后喷洒到含40.34 mg/kg抑霉唑的脐橙样本上，反应2 min后采集其SERS光谱。通过比较983和1047 cm^-1波段处的SERS信号强度与金胶加入量的关系来确定最佳的金胶量。

为研究不同电解质溶液的加入量对SERS强度的影响，将400 µL金胶分别与25 µL的CaBr₂溶液、CaCl₂溶液、NaBr溶液和NaCl溶液混合均匀后喷洒到含40.34 mg/kg抑霉唑的脐橙样本上，反应2 min后采集其SERS光谱。通过比较983和1047 cm^-1波段处的SERS信号强度与电解质溶液（CaBr₂、CaCl₂、NaBr和NaCl）的直方图来确定最佳的电解质溶液。

为了研究不同NaBr加入量对SERS强度的影响，将400 µL金胶分别与0、10、15、20、25、30 µL的NaBr溶液混合均匀后喷洒到含40.34 mg/kg抑霉唑的脐橙样本上，反应2 min后采集其SERS光谱。通过比较983和1047 cm^-1波段处的SERS信号强度与NaBr加入量的折线图来确定最佳的电解质溶液。

将400 µL金胶与25 µL的NaBr溶液混合均匀后喷洒到含抑霉唑的脐橙样本（1.43~40.81 mg/kg）上，反应2 min后采集其拉曼光谱。得到65个含抑霉唑的脐橙样本，从中随机挑选35个建立预测模型，剩余的30个脐橙样本则用作预测集，用来评估该模型的预测性能。

为对比理论数据结果和试验结果之间的一致性，采用密度泛函理论（Density Functional Theory，DFT）计算方法对抑霉唑分子的振动归属进行理论运算分析。

抑霉唑的3D分子结构采用Gauss View 5.0构造，Gaussian 09W软件计算理论抑霉唑分子的拉曼光谱频率，在计算时采用DFT方法中的B3LYP/6-31G（d，p）基组。C、H、Cl、N和O原子也采用6-31G（d，p）基组，在Gaussian 09中显示计算结果。对拉曼位移用该机组相对应的校正系数（0.961）校正。其中基组为该电子体系内轨道的数学描述，“6”解释为内层轨道的函数数量；而一个基组中含3个高斯函数（Gaussian Type Orbital， GTO），每一个Slater函数（Slater Type Orbital， STO）由6个GTO展开，“31”解释为两组STO描述的价层的轨道；“d”和“p”分别是对分子中的C、Cl、N、O原子和H原子做的极化函数^［16］。

抑霉唑的分子式为C₁₄H₁₄Cl₂N₂O，由1个烯丙氧基连接1个二氯苯基官能团组成。优化后得到的抑霉唑分子结构如图1所示，主要包括C、C-H、C=C-H、C-O、N=C-N、C-N、N-C-H和C-N-C等基团。

图2（a）为理论计算的抑霉唑拉曼光谱，图2（b）为实际测得的抑霉唑标准品的拉曼光谱。通过对比两者的特征峰归属可发现，1176和1378 cm^-1波段处特征峰的拉曼信号强度较弱。这可能是由于这两个位移处分别在苯环上有微弱的面外弯曲和面内弯曲振动所引起。结合表1和图2可得，抑霉唑标准品在690 cm^-1波段处的特征峰是由于苯环弯曲振动、CH₂面内摇摆、C-C面外弯曲、二氯苯基面外弯曲共同作用产生的；983 cm^-1波段处的振动可能是由于苯环弯曲振动、二氯苯基上C=N-C和C-N-C与C=C-N的弯曲振动共同作用产生；1041 cm^-1处的峰是由C-H剪式振动、C=C-H面外弯曲振动和CH₂面内弯曲振动共同作用产生。图2中理论计算光谱与标准品的拉曼光谱的特征峰匹配可发现，最小偏差为0，最大偏差为10。这可能是由于实际测量拉曼光谱的标准品为固体粉末，其之间存在相互作用力，而理论计算时的形态为理想的气态单分子，忽略了分子间作用力。基于此，理论计算的抑霉唑拉曼光谱很好地印证了实测的抑霉唑拉曼光谱的正确性，可以将实测的抑霉唑标准品拉曼光谱作为后续分析脐橙表面抑霉唑残留的参考依据。

由图3可知，含抑霉唑的脐橙样本在983与1047 cm^-1波段处有区别于空白脐橙样本的拉曼特征峰。而抑霉唑标准品拉曼光谱在983与1041 cm^-1波段处均有特征峰，并在1041 cm^-1波段处有6 cm^-1的偏差，这可能是由于脐橙本身较强的背景峰影响导致的。因此，可以将这两处特征峰作为鉴别脐橙果皮中是否含抑霉唑的依据。

由图4可知脐橙与金胶和NaBr溶液混合物的反应时间不同，SERS信号强度不同。随着反应时间的增长，983和1047 cm^-1处的SERS强度均呈现出持续下降的趋势。产生这种现象的原因可能是刚开始吸附时，脐橙果皮的抑霉唑与金胶及NaBr溶液充分混合，使得该活性位点处的SERS信号得以迅速增强^［17］。吸附时间过长会使金胶纳米粒子凝聚过度从而产生沉淀，降低抑霉唑与金胶结合的效率^［18］。但是由于0 min的反应时间在实际操作中比较困难，故本研究选择2 min作为最优的反应时间。

SERS主要是通过分子吸附在金和银等粗糙金属的表面，从而使局部表面产生等离激元共振效应，对SERS强度起到增强的效果^［19］。由图5可看出，随着金胶加入量的增大，983与1047 cm^-1波段处的拉曼特征峰强度呈先减小后增大再次减小的趋势。出现这种现象可能的原因是当金胶的量增大到一定程度时，有更多的抑霉唑分子吸附在纳米金胶颗粒的表面，使得983 cm^-1的特征峰在560 µL时的SERS信号达到最强，1047 cm^-1的特征峰在400 µL时的SERS信号达到最强。而在金胶加入量为400 µL时983 cm^-1波段处的SERS强度为次强点，仅次于560 µL处的SERS强度。综合考虑，本研究选择最优金胶加入量为400 µL。

电解质溶液对SERS强度的增强效果取决于离子对金胶表面状态的影响及离子对金胶纳米粒子的吸附能力^［20］。图6可看出，金胶与CaBr₂的混合溶液在983 cm^-1波段处的SERS强度达到最强，金胶与NaBr的混合溶液在1047 cm^-1波段处的SERS强度最强。出现此现象的原因可能是由于氯离子的盐析能力大于溴离子的盐析能力，导致溴离子与金属粒子的表面络合能力强于氯离子，结果表明含溴离子的化合物（NaBr和CaBr₂）对SERS强度的增强效果明显大于含氯离子的化合物（NaCl和CaCl₂）对SERS强度的增强效果^［21］。其次，NaBr在983 cm^-1特征峰处的SERS强度仅次于CaBr₂。综合考虑，本研究选择NaBr作为最优的电解质溶液。

在纳米金胶溶液中加入不同量的NaBr，可能会对SERS信号产生影响，因此有必要对电解质溶液的加入量进行优化^［22］。从图7可看出，当NaBr加入量为10 µL时，1047 cm^-1波段处的SERS信号强度达到局部最高。当NaBr加入量增大到25 µL时，983 cm^-1波段处的SERS强度达到最高点，而1047 cm^-1波段处虽未达到最强，却仅次于最强点。可能的原因是当卤族元素的量高到足以聚合时，使局部的电磁场增强，从而增强SERS信号。而当加入过量NaBr后，会加剧金纳米粒子的聚集从而发生沉淀^［21］，进而降低SERS信号强度。因此本试验确定了NaBr溶液的最佳加入量为25 µL。

为减少光谱分析过程中受到噪声、基线漂移等因素干扰，在建立模型之前有必要对原始光谱进行光谱预处理^［23］。目前常用的光谱预处理方法主要有air PLS、归一化、基线校正、一阶导数、二阶导数、标准正态变量（Standard Normal Distribution，SNV）和多元散射校正（Multiplicative Scatter Correction，MSC）等^［23,24］。其中基线校正、一阶导数和二阶导数的作用主要是扣除漂移或背景对结果的影响，在改变了原始数据相关性的变化趋势的同时，也有效提高了某些位置光谱的相关性。在光谱数据分析时，样本的误差表现在无规则分布或样本颗粒大小各异，而MSC和SNV可以消除该误差对光谱分析结果的影响，还能够提高原始光谱与预处理后光谱之间的相关性。归一化能够消除由于尺寸差异过大对分析结果带来的误差^［23］。因此，本研究以自适应迭代惩罚最小二乘法（Adaptive Iterative Reweighted Penalized Least Squares，air PLS）、air PLS+归一化、air PLS+基线校正、air PLS+一阶导数、air PLS+SNV和air PLS+MSC处理后的6组光谱数据为研究对象，分别采用这6组光谱预处理法建立SVR模型并进行预测性能的比较。

由表2可知，air PLS、air PLS+SNV、airPLS+MSC三组光谱预处理方法所建立模型的训练集相关系数（Coefficient of Determination for the Training Set，R _T）的值均达到0.96以上。且三者的训练集均方根误差（Root-Mean-Square Error of Training set，RMSEC）的值相差不大，稳定在3.7附近。然后对该三种方法的预测集相关系数（Coefficient of the Determinant for the Prediction Set，R_P）进行比较，air PLS方法建立模型预测的预测集R_P为最大，预测集均方根误差（Root-Mean-Square Error of Prediction，RMSEP）为最小。因此，本研究最终选择air PLS作为脐橙表面抑霉唑残留的SVR预测模型的光谱预处理方法。

建立模型之前对光谱数据进行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）特征提取。一般来说，主成分分析时主成分的方差贡献率达到90%以上即可作为主要光谱信息的特征^［25］。由表3可知，前7个主成分的累计方差贡献率已达91.94%。因此，选择前7个主成分的得分值作为SVR预测模型的输入值。

为评价模型的预测精度和效果，采用了SVR、多元线性回归（Multiple Linear Regression，MLR）和偏最小二乘回归（Partial Least Squares Regression，PLSR）三种建模方法进行分析比较。其中，SVR预测模型的类型为epsilon SVR，核函数为径向基核函数，epsilon值为0.1，惩罚因子C值为10。

通常选择R_P、RMSEP和相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RPD）的值来评价模型性能。其中，R_P和RMSEP分别用来解释真实值与预测值的相关性和精确度的能力。R_P越大，RMSEP越小则说明该模型的拟合程度越好，准确性越高^［25］。RPD值则是对模型预测能力的评估，RPD值越大（不小于1），说明预测效果越好，其预测结果越接近实测值^［25］。

由表4可得，基于SVR建立模型预测的R_P为SVR、MLR、PLSR三者中的最大，RMSEP为最小。因此，基于SVR算法对脐橙表面抑霉唑残留的预测值越接近实测值，能有效提高模型预测准确性。其中，最低检出限为1.43 mg/kg（国家于《GB 2763-2019 食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中规定抑霉唑在脐橙中残留最大限量为5 mg/kg）。

为进一步做预测分析，在随机挑选35个样本建立模型之后，剩余的30个样本作为预测集进行验证，即脐橙果皮抑霉唑残留浓度分别为38.93、30.45、21.53、14.63、9.24和4.05 mg/kg的样本，实测的真实值与预测值之间的关系如图8，R_P为0.9156，RMSEP为4.8407 mg/kg。

本研究探索了SERS技术在检测脐橙果皮中抑霉唑农药残留的可行性。首先通过对比983和1047 cm^-1两处波段的SERS强度，进行抑霉唑残留的SERS检测条件优化，分别确定了最优的检测条件（2 min的反应时间，400 µL的金胶加入量，NaBr作为电解质溶液且添加量为25 µL）。在最优条件下，对含抑霉唑的脐橙果皮拉曼光谱采用6组不同的光谱预处理方法，分别对这6组光谱所建立模型的预测性能进行对比，最终采用air PLS的光谱预处理方法。经过PCA的特征提取，选择前7个主成分得分作为脐橙果皮抑霉唑残留的SVR预测模型的输入值。最后SVR预测模型的R_P可达0.9156，RMSEP为4.8407 mg/kg，RPD为2.3103。由于本研究所采用的计算实际残留浓度的方法为称重法，挥发时间不一致容易造成称量误差，进而影响最终实际残留浓度的计算。因此实际残留浓度的计算方法还有待进一步改善。研究结果表明，SERS技术可实现脐橙果皮抑霉唑残留的快速检测。