0 引 言
柑橘类水果以其丰富的营养成分和独特的风味而闻名，在世界范围内受到消费者青睐［1］。随着人们生活水平的不断提高，对柑橘的品质需求有所提升。为满足消费者和市场需求并保障柑橘的品质，对其进行高效、无损的检测是必不可少的。在过去的几年中，可见/近红外光谱（Visible/Near-Infrared Spectroscopy, Vis/NIRS）作为传统方法的替代方法以其低成本、高效率、无损的优势，在水果品质检测领域取得了广泛的研究和应用［2］，如苹果［3］、猕猴桃［4］、草莓［5］、柚子［6］和梨［7］等。然而，应用Vis/NIRS进行水果质量检测的主要障碍是有限的光穿透深度，这在厚皮类水果的品质检测中尤为突出。
近年来，Vis/NIRS技术在柑橘品质检测中的应用受到持续关注，Liu等［8］、Wang等［9］及Xiao等［10］基于化学计量学方法，建立了光谱与品质参数（如水分、可溶性固形物含量和酸度）之间的定量或定性模型。然而，这些研究多属于黑箱方法，减弱或忽略了光在果实组织内的复杂传播规律，导致模型的精度和鲁棒性不足。在光学领域，水果组织被界定为典型的浑浊介质。当光穿透水果组织时，其衰减实质上是吸收系数（μa）与约化散射系数（μs'）共同作用的结果。通过Vis/NIR技术获取的光谱信号，实质上是光子与水果组织的组织层结构（果皮、果肉等）相互作用后的宏观表现，受到水果不同层组织的光学特性（Optical Properties, OPs）影响。其中μa主要表征光子能量被化学成分吸收的损耗程度，μs'则反映光子由于组织结构特征引发的散射路径改变的情况。
以空间分辨技术（Spatial Resolution, SR）、空间频率域（Spatial Frequency Domain, SFD）和时间分辨技术（Time Resolved, TR）为代表的新型光学检测技术，为水果光学特性参数的测量提供了新的解决方案。其中，Pu等［11］利用空间分辨技术对荔枝的光学特性进行测量，并指出光学特性可以用于成熟度的判别。Mollazade等［12］利用时间分辨技术对苹果的光学特性进行测量，并基于μs'建立了果实粉状变质情况的识别模型。需指出的是，多数水果都具有多层的组织结构，忽视不同组织层间光学特性参数的差异，不仅可能导致光学参数检测出现误差，更会造成各组织层关键理化信息的丢失。尽管积分球技术结合逆向加倍法（Integrating Sphere-Inverse Adding-Doubling, IS-IAD）在光传播过程中存在因能量衰减引起的参数误差，但该方法依然是光学特性研究的标准手段［13］，IS-IAD方法已经应用于苹果［14］、草莓［15］和猕猴桃［16］等水果中。
柑橘类水果的果皮由油胞层和海绵层组成，这种特有的双层结构使得光在水果组织中传播涉及更复杂的吸收和散射机制，并且光对果皮的透过性差，光子大部分被油胞层、海绵层反射，只有小部分光子能传输到果肉组织，所以得到的果肉信息较少。因此研究光在多层组织中的传播规律，了解不同组织层的贡献率，最大程度获取果肉的信息是非常重要的，同时也为柑橘类水果检测系统的设计提供了依据。
对柑橘的Vis/NIRS检测时，有反射和透射两种模式来获取光谱信号。透射模式的光子需要穿透完整水果样本，才能得到有效信息，所以这种模式受限于水果样本的尺寸和果皮组织厚度；反射模式的光子传播路径小于透射模式，不仅降低了对样本的物理限制要求，还可以获得更高信噪比的光谱信号。然而，反射模式有限的光穿透深度可能会导致大部分光被柑橘表皮吸收、反射，难以检测到更多关于柑橘果肉的信息。因此，研究光在多层柑橘组织中的传播，了解光子在各组织层内的路径长度，对于最大限度地获取与果肉相关的信息是非常重要的。
蒙特卡罗（Monte Carlo, MC）模拟是一种强大的工具，因其在浑浊介质光传输研究中的良好表现，被认为是研究复杂介质光传输的黄金标准方法［17］。传统的蒙特卡罗多层编码（Monte Carlo Multi-Layer, MCML）已被广泛用于研究光与组织的相互作用，Zhang等［18］和Xiao等［19］使用MCML分别研究了500~1 400 nm波长下三层蓝莓组织和五层马铃薯组织内的光传播规律。然而，他们忽略了水果的弯曲3D结构，而表面曲率会对模拟结果产生影响。基于体素的蒙特卡罗模拟（Monte Carlo eXtreme, MCX）为复杂3D生物组织中准确和高效的光子传输建模提供了更大的灵活性［20］。Wang等［21］使用MCX建立了三层球型模型研究光在苹果组织中的传播规律并进行漫反射模式下的光源检测器角度的优化。Joseph等［22］使用MCX模拟建立了四层圆柱形模型，优化了完整梨果实中氧气监测装置。这些研究表明，MCX模拟有助于了解光在水果组织中的传播规律，并研究相应的检测装置。
因此，本研究对象为“武鸣”沃柑，研究目标一是通过IS-IAD方法获取沃柑不同组织层（油胞层、海绵层和果肉组织）的OPs（μa和μs'），并比较沃柑不同组织层之间的OPs差异；二是研究多层沃柑组织中的能量分布，以及光在整个沃柑组织中的穿透深度；三是研究多层沃柑组织中的光传播，以及每个组织层对检测到的信号的贡献。
1 材料与方法
1.1 样品制备
2024年4月从广西北流寻味农业公司购买沃柑样本，选取30个直径在60~70 mm范围内、表面无瑕疵的沃柑进行实验。样品在20±1 ℃和90%±5%的相对湿度环境下存放24小时，确保沃柑温度与环境温度一致，减少温度对实验结果的影响。为研究沃柑不同组织结构的OPs，对果实样品进行分层切片处理。使用切片机在沃柑赤道处依次切片制取长宽为3 cm，厚度为0.1 cm的油胞层、海绵层样本。果肉组织样本采用液压装置压榨获取果汁，收集果汁注入5 mm厚度的玻璃容器，使用精密镊子将完整分离的汁囊逐个放入果汁中，通过汁液渗透填充果汁囊泡之间的间隙，既保持汁囊原有形态又有效排除气泡干扰。
1.2 光学特性的测量与计算
利用华东交通大学智能装备创新研究院搭建的单积分球系统来测量沃柑组织的光学特性。该系统主要由计算机、积分球（4 P-GPS-033-SL, Labsphere, New Hampshire, USA）、卤钨光源（20W， HL-2000-FHSA, Ocean Optics公司, USA）、光谱仪（QE65pro（347~1 171 nm），Ocean Optics，Dunedin, USA）、一个定制的光束发散小于2°的准直器（Isuzu Optics, 中国上海）、滑台等组成。积分球在赤道面的0°、90°、180°和顶部各有一个直径为25.4 mm的孔口。其中0°处的孔口作为进光口，可通过缩孔器在25.4~38.1 mm范围内调整，90°处的孔口通过光纤与光谱仪连接，180°处的孔口作为出光口，顶部处的孔口被封盖。积分球的内表面涂有聚四氟乙烯，反射率高于98%。样品由石英玻片夹持，其透光率高于93%。图1a和图1b分别显示了用于测量总漫反射率（Total Diffuse Reflectance, Rt）和总漫透射率（Total Transmittance, Tt）的积分球系统。为确保测量数据的可靠性：首先，在每次实验前将积分球系统预热30 min，使积分球系统达到稳定状态；其次，将整个测量系统置于密闭黑箱内操作，从而避免外界环境光对测量数据的影响。
逆向加倍法（Inverse Adding-Doubling, IAD）反演沃柑组织光学特性参数需要测量组织总反射率R t、总透射率T t和沃柑组织样本的折射率。总反射率测量时，首先在关闭光源状态下将准直器推入积分球进光口（深度为一个球体直径），采集反射参考暗光谱R dark；随后开启光源，获取反射参考亮光谱R ref；最后将沃柑组织切片放置在入口端的样品架上，以采集样本反射光谱R sam。通过公式（1） 计算样品总反射率R t。
式中：R t为总反射率；R sam为样本反射光谱；R dark为反射参考暗光谱；R ref为反射参考亮光谱。
总透射率测定则需调整系统配置，将准直器置于进光口外侧并密使用端口盖覆盖出口端，关闭光源后，采集透射参考暗光谱T dark；开启光源后获得透射参考亮光谱T ref；将沃柑组织切片放置在入口端的样品架上采集透射光谱T sam，最终通过公式（2） 计算样品总透射率T t。
式中：T t为总透射率；T sam为样本透射光谱；T dark为透射参考暗光谱；T ref为透射参考亮光谱。
为了在测量R t和T t时获得3 mm的恒定光斑直径，准直器与样品之间的距离保持恒定在6 cm。关于IS系统的详细信息可以在Zeng等［23］的研究中找到。在计算总反射率和总透射率时，为了减小误差，在样品上选取三个点后，使用精度为±0.001 mm的螺旋千分尺测量三点处的切片厚度，然后在不同的点上进行三次光谱收集，然后取其均值。折射率采用阿贝折射计（2WAJ，上海索艾夫有限公司，上海，中国）测量。
1.3 积分球测量系统验证
在实验开始前，需要对积分球测量系统进行验证，以确保积分球系统的正确性。Intralipid-20%溶液由于其强散射和低吸收特性，被用来验证μs'，而μa则用蒸馏水作为基准物质。蒸馏水的μa参考值来源于叶荣春等［24］的论文；Intralipid-20%溶液的μs'参考值从Moran等［25］公式中计算获得。使用积分球系统对Intralipid-20%溶液进行测量时，采用1 mm光程比色皿（JGS-1，3×38×50 mm）；对蒸馏水进行测量时，选用5 mm光程比色皿（JGS-1，7×50×50 mm）来增加水对光子的吸收作用。最后将两者进行对比，使用公式（3） 计算测量值与参考值之间的相对误差（%）来对积分球系统进行验证：
式中：H a测量为测量值；H a参考为参考值。
1.4 估算沃柑各个组织的光透射深度
光在生物组织中的传播伴随着衰减，主要由吸收和散射机制共同作用。基于扩散理论，取1作为入射辐照度，穿透深度（σ）被定义为入射光强度衰减至1/e（约37%）时的传播距离，可由光学特性参数μa和μs'计算获得。穿透深度的计算方法如公式（4） 所示。
式中：μa为吸收系数；μs'为约化散射系数。
1.5 多层组织中的蒙特卡罗模拟
采用MCX研究了漫反射模式下光在完整沃柑果实中的传播。基于各波段下的平均光学特性，MCX可以通过检测器的分布得到不同位置检测器的平均光学衰减、路径长度以及捕获的光子数量，还可以得到三维模型中各个网格的光通量、吸收的能量和光子轨迹等数据。与其他MC模拟不同的是，MCX使用微观比尔朗伯定律（MicroscopicBeer-Lambert Law Method）来定义光在水果组织中的传播规律，其中，μa只与光衰减有关，μs'只与光子的传播路径有关。检测接收到的第i个光子的重量用wi 表示，具体为公式（5） 。
式中：w 0为每个光子的初始权重；wi 为第i个光子的权重； 为第j层组织的吸收系数，dj 为光子第j层组织中的局部光程长度。
表1 三层沃柑组织光传输研究蒙特卡罗模拟的输入参数Table 1 Input parameters for Monte Carlo simulation of light transport in three-layer orah mandarin tissue |
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 光子数 | 10 000 000 |
| 体素大小 | 200 × 200 × 200 mm3 |
| 模型区域大小 | 200 × 200 × 200 mm3 |
| 检测器半径 | 2 |
| 光源半径 | 2 |
| 油胞层、海绵层和果肉的厚度 | 3， 4和93 mm |
1.6 仿真验证
在进行多层模拟之前，使用MCX对果肉组织样本在500~1 050 nm波长范围内进行模拟验证，来评估模拟的准确性。为了提高效率，选取5个厚度为5 mm的果肉组织样本的平均光学特性参数，进行单层模拟验证。将模拟得到的总反射率和总透射率与积分球测得的总反射率（R t）和总透射率（T t）进行对比来说明模拟的结果。通过公式（6） 计算每个波长处的测量值和模拟值之间的相对误差（%）。
式中：R t和T t分别为测得的总反射率和总透射率；R t模拟和T t模拟分别为模拟的总反射率和总透射率。
1.7 仿真中检测效率评价
光子从光源发射进入沃柑组织后，大部分光子被组织完全吸收，少数光子穿透沃柑组织，剩余部分光子经过反射后被检测器吸收。因此，本研究采用“检测到的光子数量与发射光子总数的比值”来计算光学漫反射率。该方法与Joseph等［22］的处理方式一致，均采用统计有效光子占比的方法来表征反射信号强度，从而验证了本模拟中表征反射信号强度方法的可靠性。
2 结果和讨论
2.1 积分球系统的验证
如图3所示，μa的测量值与参考值均呈现随波长增加而逐渐减小的整体趋势。μa在980 nm处有一个显著的吸收峰，这可能是由于水分子的吸收引起的，在740 nm出现一个明显的波谷，此时间μa达到局部最小值。在800~1 000 nm波段范围内，吸收系数测量值与参考值的平均误差只有6.91%，验证了积分球系统在此波段范围内测量的准确性；但是测量值在400~800 nm范围内有显著的基线漂移，这可能由于样品边缘的直接光和漫射光损失导致吸收系数测量值偏高。
如图4所示，μs′测量值与参考值都呈现随波长增加而减少的整体趋势，在400~880 nm范围内测量值高于参考值，但在880 nm之后出现相反的现象。400~665 nm范围内出现局部偏差，误差最大为12%，这种误差可能源于不同厂商生产的Intralipid-20%溶液粒径分布的差异，导致信号两端的信噪比较差。综合来看，在400~1 050 nm波长范围内，积分球系统测量的μa值、μs'值与参考值整体吻合。
2.2 沃柑组织的光学特性
如图5a所示，在吸收系数μa曲线中，沃柑不同组织吸收系数随波长变化趋势相同，油胞层的吸收系数明显高于沃柑其他组织。沃柑的不同组织在500和980 nm附近存在两个绝对峰值强度有所不同的吸收峰，在500 nm处的吸收峰可归因于类胡萝卜素在984 nm附近的吸收峰主要与来自碳水化合物和水的羟基有关。
2.3 沃柑组织的光穿透深度
图6显示了沃柑不同组织的光穿透深度。油胞层、海绵层和果肉组织的光穿透深度呈现相同的变化趋势，全波段范围内光子在果肉组织中的穿透深度高于油胞层、海绵层，这是由于较低的散射能力使得果肉的穿透深度显著高于其他组织的穿透深度。在500~600 nm范围内海绵层的光穿透深度高于油胞层，可能是由于沃柑油胞层中的色素对此波段的吸收能力更强。在600~1 050 nm波段范围内，油胞层中的脂溶性物质吸收系数较低，使得光更容易穿透；而海绵层由于其疏松的结构，会引发光子的显著的散射使光程增加、穿透深度降低。因此，该波段范围内油胞层的光穿透深度高于海绵层。海绵层和油胞层的光穿透深度在675 nm附近呈现出波谷，这可能是因为高吸收的色素，如类胡萝卜素和叶绿素吸收了大部分的能量，较高的类胡萝卜素使得海绵层的波谷更加明显。在900~1 050 nm范围内，由于碳水化合物和水分子的吸收，沃柑的三层组织层在980 nm附近均出现了波谷，其中果肉组织因含水量更高，吸收峰更为显著。Vega-Castellote等［28］对西瓜光穿透深度的研究也显示较小μa值区域的光穿透深度高于较大μa值区域的光穿透深度。
2.4 多层沃柑组织中光传播的模拟
2.4.1 光传播模拟的验证
MCX模拟数据和实验数据之间的比较见图7，500~950 nm范围内模拟的反射率略高于实验值，透射率同样如此。不一致的结果可能是由IAD算法和MCX模拟本身的统计性质引起的［29］。样品制备和实验设置中的错误也可能导致模拟中的错误。模拟的反射率和透射率的平均相对误差分别为9%和15%。总体而言，模拟结果与实验数据具有较好的一致性，说明模拟得到的结果足够真实可靠。
2.4.2 多层沃柑组织中的光能分布
MC模拟研究表明，光在沃柑这类厚皮水果组织的传播主要分为漫反射和内部吸收，能够透射的光子数量非常少。如图8a所示，全波段范围透射能量占比最高达到4.2%，说明透射模式在沃柑无损检测中的应用相对困难。在500~640 nm范围内，随着波长的增加，沃柑组织的吸收率逐渐降低，经过一定的增加，最后在750 nm附近达到35%的最小值。在750~1 050 nm范围内，由于水的吸收作用，沃柑组织吸收的能量占比有了较小的增加。从图8a中可以看出，吸收率与反射率在光谱变化上呈现显著的负相关特性。沃柑不同层组织的吸收分数可以在一定程度上反映对检测到的光谱信号的贡献。果肉作为可食用部分，因其肉质丰满，可溶性固形物含量丰富的特点，在光谱检测中被作为主要研究对象。图8b显示了每个沃柑组织层的吸收分数，对于油胞层，其沿着波长的吸收分数显示出与图8a中的总吸收分数相似的趋势。此外，油胞层吸收了500~550 nm和1 000~1 050 nm范围内的大部分能量。海绵层的吸收分数在大多数波长范围内稳定在8%~13%之间。在果肉组织中，其吸收分数表现出随着波长增加的趋势，在980 nm附近到达最大值4.5%。
2.4.3 沃柑多层组织吸收能量密度分布
沃柑作为厚皮果，光子很难穿过油胞层和海绵层，导致进入果肉层的光子很少。在750 nm附近，沃柑组织的总吸收能量达到最低值，代表了较低的吸收水平。因此，研究了多层沃柑组织在750 nm处的光传播模拟。图9显示在750 nm处多层沃柑组织中不同位置之间的吸收能量密度分布。光子由光照点进入沃柑组织时，能量主要被油胞层和海绵层吸收，此时可以观察到吸收能量密度的轮廓间隔很小，光衰减严重。当光子穿透果皮进入果肉组织时，轮廓间隔变得很大，并且光子以相同的衰减被传输得更远。产生这种现象的原因是由于油胞层与海绵层具有更高的约化散射系数，导致单位网格内光子散射次数增加，从而增加网格内的光程长度，加剧了光子能量的沉积。较大μa的组织层具有较强的吸收能力，会在较小范围内迅速吸收光子能量，而具有较小μs'的组织层使光子倾向于向更深的区域传播。这种能量沉积的分布趋势与沃柑组织的光学特性一致。
2.4.4 沃柑组织层对检测到的光谱信号的贡献
随着光源探测器距离的增加，油胞层、海绵层和果肉组织中探测到的光子在各位置的平均路径长度（图10a）和平均光衰减（图10b）逐渐增加。其中海绵层和果肉组织增加得十分缓慢。平均路径长度的增加可能与不同层的厚度和μs'的差异有关，海绵层具有最强的散射能力，平均光程比较大，而较薄的厚度使光程长的增加沿着距离的变化较慢。虽然油胞层的层厚也非常小，但是油胞层远小于海绵层的μs'使得平均路径长度的增加明显。而平均光衰减的变化则与μa有关，油胞层的μa值较大，对光子的影响进一步放大，表现出较大的平均光衰减。海绵层较小的μa值导致平均光衰减较小，同时平均路径长度变化的缓慢导致海绵层的平均光衰减变化缓慢。在果肉组织中探测到的光子的平均光程与衰减值显著低于油胞层和海绵层，但是平均路径长度沿着光源探测器距离变化很大。当光源-检测器距离从1 mm增至25 mm时，果肉组织的平均光程呈指数增长，平均衰减系数增加三个数量级。这可能由于在光源-检测器距离增加时，较小的μs'值和最大的组织层厚度使得光子的平均路径长度比较小变化大。
为了进一步量化沃柑组织层对检测到的光谱信号的贡献，将每个组织层中检测到的光子的光学衰减相加，并分别计算每个组织层的分数。如图10c所示，随着光源检测器距离的增加，油胞层与海绵层的信号贡献率逐渐降低，而果肉组织的贡献率显著增加。果肉对检测信号的贡献从光源检测器距离为1 mm时的2.24%增加到光源检测器距离为10 mm时的5.31%；在光源检测器距离为13mm时果肉组织的贡献率显著跃升，相较于12 mm提高了44%，然后在光源检测器距离为20 mm时迅速增加到49.68%。该现象与Yang等［30］采用MCX研究环形光源下三层球型甜瓜组织的光传播规律一致，果肉贡献率随光源检测器距离的增加呈现相同的趋势。但是由于水果品种的差异导致的μa和μs'不同和模型参数设置不同，其组织层的贡献率也有所不同。
光源检测器距离的增加虽然会提升果肉组织对检测到信号的贡献，但这并不意味着在实际应用中要选择最大的光源检测器距离，还应该考虑最终检测到信号的强度。由于检测器最高检测到106个光子，会导致测得的漫反射率最高为10%。如图10d所示，在小于8 mm的间距下，实际的漫反射率应该高于10%。当间距超过8 mm时，漫反射率随距离增加而迅速减小。当光源检测器距离为15 mm时，入射光子的数量相同时仅能捕获1.557 2%的反射光子。这意味着需提升入射光子的数量，即采用更大功率的光源或配备高增益前置放大器的探测器。但是更大功率的光源可能对水果造成损伤，配备高增益的前置放大器会导致体积过大，不便于携带。所以需要同时考虑果肉组织的贡献率和光源功率，获取沃柑的有效信息。综上所述，在波段选择方面，应优先考虑具有较低的吸收水平的750 nm波长；在检测装置方面，建议将光源-探测器距离设置在13~15 mm之间，在此范围内可以确保果肉组织信号贡献率较高的同时，获得足够强的漫反射信号强度。
3 结 论
本文以沃柑为研究对象，使用单积分球系统测量了沃柑油胞层、海绵层和果肉组织的OPs，并利用蒙特卡罗模拟研究了光在沃柑果实中的传播。油胞层因富含类胡萝卜素等脂溶性色素，μa在500 nm处呈现峰值；而海绵层因其多孔隙的结构导致μs'偏高，果肉组织则因半透明特性表现出最低的μs'。在整个波段范围内，油胞层和海绵层的平均μa光谱、平均μs'光谱表现出一致的变化趋势。MC模拟结果表明，光在沃柑组织中以吸收为主，且能量沿波长主要被油胞层、海绵层吸收。在反射最大的特征波长下，随着光源探测器距离的增加，各组织层的平均光程和光子衰减增加，果肉对探测信号的贡献逐渐增大，而探测到的光学漫反射率呈指数下降。模拟结果建议沃柑的检测装置的光源探测器距离应选择13~15 mm之间，在确保果肉组织信号贡献率较高的同时，获得足够强的漫反射信号强度。本研究为开发基于可见/近红外光谱的沃柑果实无损检测技术或仪器提供了参考。
